PRÁCTICO DE PROTEINAS

PRÁCTICA 1

Objetivo

Determinar el carácter proteico de varias sustancias mediante ensayos con biuret y xantoproteico.

Materiales y sustancias 

- Vaso de bohemia

- Varilla de vidrio

- Mechero

- Soporte

- Tela metálica

- Gradilla

- Tubos de ensayo

- Termómetro

- Papel de filtro

- Leche descremada

- Ácido etanoico 2,0 M

- Hidróxido de sodio al 10%

- Sulfato cúprico al 1%

- Ácido Nítrico concentrado 

Reactivos utilizados

- Biuret
Para obtener una reacción de biuret tendremos que agregar sobre la muestra 20 gotas de NaOH al 10% y luego 4 gotas de solución CuSO4 al 1%. 

- Xantoprotéico
Para obtener una reacción Xantoprotéica debemos agregar 10 gotas de HNO3 concentrado y esperar unos minutos a que reaccione y observar resultados.

Fundamentos de la técnica

El objetivo de la experiencia es determinar si las muestras experimentadas tienen carácter proteico. 

Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme cantidad de funciones diferentes. Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas.
Para ello recurrimos al ensayo de Biuret y Xantoproteico.

Ensayo de Biuret

El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina de NaOH. El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosado cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Sodio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar la reacción.

La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso quiere decir que un resultado positivo no necesariamente tenga carácter proteico por lo que hay falsos postivos. Tiene que ser evaluado cuidadosamente para que el resultado no sea un falso positivo.

Un resultado negativo de la reacción del biuret sobre una muestra no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir:
a) que no existan proteínas en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas),
b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo). Esto puede evitarse si se conoce de antemano la composición de la muestra.
c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor.

  

Fórmula química de Biuret

Reacción de Biuret

   




  







Ensayo de Xantoproteico

Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo.  La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina.

 

Reacción de xantoproteica

Análisis de las muestras y conclusiones

CASEINA

La caseína es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno. Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6).

Procedimiento
1) Colocar leche en polvo y agua en vaso de Bohemia.
2) Agitar hasta homogeneizar.
3) Calentar hasta aproximadamente 40ºC, agitando con la varilla de vidrio
4) Retirar del fuego
5) Agregar ácido etanoico gota a gota hasta la coagulación de la caseína
6) Separar los coágulos de caseína, del suero
7) Secarlos con papel absorbente
8) eparar dos porciones del sólido en dos tubos de ensayo

Reaccion de Biuret

A uno de los tubos de ensayo que posee la muestra se le agrega 20 gotas (1,0ml) de NaOH al 10%. Luego se le agrega 4 gotas de solución CuSO4 al 1%.

Luego de hacer el Biuret sobre la muestra observamos que queda de color violeta. Concluimos que la muestra es positiva, ya que posee por lo menos 2 enlaces peptídicos.

Reaccion de Xantoproteica

En el segundo tubo de ensayo se le agrega 10 gotas (0,5ml) de HNO3 concentrado

Como se ve en la imagen, el resultado con la muestra xantoproteica dio de color amarillo por lo tanto es positiva, ya que posee tirosina o triptófano en la caseína.

OVOALMBUMINA

La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Pertenece a la superfamilia proteínica de las serpinas, aunque a diferencia de la mayoría de éstas la ovoalbúmina no es capaz de inhibir cualquier peptidasa.Es llamada fosfoglucoproteína integrada por tres fracciones, A1, A2 y A3, en una proporción de 85:12:3, respectivamente, que se diferencian por su contenido en fósforo. Es rica en cisteína y metionina y presenta grupos sulfhidrilos.

Procedimiento

Dada la clara del huevo por el profesor de practico. Poner en dos tubos de ensayos diferentes una muestra de esto. 

Conclusión

Luego de haber realizado el Biuret a una de las muestra, esta comienza a tornarse a color violeta, esto quiere decir que la muestra es positiva ya que por lo menos presenta 2 enlaces peptídicos. La muestra realizada por el Xantoproteico queda de color amarillo. Lo que identifica a la muestra como una muestra positiva y esto se debe a la presencia de tirosina o triptófano en la ovoalbúmina.

Muestra de xantoproteico positiva

Muestra de biuret positiva

GELATINA

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto).

Procedimiento
1) Preparar la gelatina
2) Separarla en dos tubos de ensayos diferentes

Luego realizar las reacciones que ya veníamos haciendo en las diferente muestras. 

Conclusión

Concluimos que en la reacción de Biuret da positiva ya que queda con un color violeta  y quiere decir que presenta por lo menos 2 enlaces peptídicos. Y en la reacción xantoproteica la muestra es incolora, por lo tanto es negativa y deducimos que la gelatina no presenta tirosina o triptófano.

Muestra de Biuret positiva

Muestra negativa de xantoproteica

ASPARTAMO

El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C.La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa.

Procedimiento

      1)Colocar 4 gotas de edulcorante en diferentes tubos de ensayo

      2)Agregar un poco de agua en cada uno de ellos

Luego de realizar las reacciones que ya veníamos realizando en las diferentes muestras anteriores.

Conclusión

Concluimos que en ambas reacciones dan negativas, por lo tanto el aspartamo no presenta enlaces peptídicos ni tirosina o triptófano.

La  muestra de la izquierda muestra la reacción xantoproteica negativa
y la muestra de la derecha la reacción de biuret negativa

GLICINA

La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. La glicina no es esencial en la dieta humana, ya que todas las células tienen la capacidad de sintetizarla. Hay dos vías para sintetizarla: la fosforilada y la no-fosforilada. 

Procedimiento

1)Colocar una punta de espátula en un tubo de ensayo

2)Agregar un poco de agua

3)Realizar las reacciones mencionadas previamente

Conclusión

Concluimos que en ambas reacciones dan negativas, por lo tanto el aspartamo no presenta enlaces peptídicos ni tirosina o triptófano.

SUERO DE LECHE

El suero de leche es un líquido obtenido en el proceso de fabricación del queso y de la caseína después de la separación de la cuajada o fase micelar. Sus características corresponden a un líquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco, débilmente dulce, de carácter ácido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del 5,5% al 7% provenientes de la leche.

Procedimiento

1) Colocar leche en polvo y agua en vaso de Bohemia.
2) Agitar hasta homogeneizar.
3) Calentar hasta aproximadamente 40ºC, agitando con la varilla de vidrio
4) Retirar del fuego
5) Agregar ácido etanoico gota a gota hasta la coagulación de la caseína

6) Separar los coágulos de caseína, del suero

7) Dividir la muestra de suero en dos tubos de ensayo

8) Realizar a cada tubo de ensayo la reaccion de biuret y de xantoproteica

Conclusiones

Luego de haber realizado el Biuret a una de las muestra, esta se torna de color violeta, esto quiere decir que la muestra es positiva por lo que por menos presenta 2 enlaces peptídicos. La muestra realizada por el Xantoproteico queda de color amarillo. Lo que identifica a la muestra como una muestra positiva y esto se debe a la presencia de tirosina o triptófano en la ovoalbúmina.

Resultados obtenidos

Muestra	Biuret	Xantoproteico
Caseína	+	+
Ovoalbúmina	+	+
Gelatina	+	-
Aspartamo	-	-
Glicina	-	-
Suero de leche	+	+

PRÁCTICA 2: DIÁLISIS

Fundamento teórico

La diálisis se emplea cuando hay un fallo renal, es decir que los riñones no pueden cumplir su función correctamente, lo cual significa que al filtrar la sangre, no solo se va hacia la orina los productos de desecho sino que también las proteínas.

En la experiencia utilizamos un dializador "casero" para demostrar que las proteínas no atravesaban la membrana del dializador. De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales.

Materiales y sustancias

- Dializador (gomita elástica, papel celofán , botella cortada) 
- Vaso de Bohemia
- Ovoalbúmina
- NaCl
- AgNO3
- H2O
- CuSO4
- NaOH

Dializador

 Análisis y conclusiones

CLORURO DE PLATA

 El cloruro de plata es un compuesto químico de fórmula AgCl. Este sólido cristalino es bien conocido por su baja solubilidad en agua. Al ser sometido a luz o calor, el cloruro de plata reacciona y produce plata y cloro gaseoso. El cloruro de plata se encuentra en el mineral clorar girita.

En agua,  el nitrato de plata (AgNO3) se disocia asi:

AgNO3  >>>  Ag +    +    NO3 -

Ag +    +     Cl -  >>>  AgCl   (color blanco) (cloruro de plata)

Procedimiento

1) Colocar dentro del dializador una solución con ovoalbumina y NaCl.

2) Sumergir en un vaso de Bohemia con agua destilada

3) Tomar muestras de ambas partes del dializador después de un tiempo 

4) Agregar AgNO3 y ensayo de Biuret a ambas muestras. 

AgNO3
Podemos observar que tanto la muestra del interior del dializador como la del exterior, al agregarles AgNO3 toman un color blanco. Esto indica que en ambas muestras hay una presencia de Cl, indicando que el dializador dejo pasar los "desechos", ya que anteriormente en el exterior solo había agua destilada. 

Muestras positivas y negativas respectivamente

Reaccion de Buiret

Luego de aplicar la reacción de Biuret a diferentes muestras del exterior e interior de la diálisis, podemos observar que en el interior nos da positivo. Esto quiere decir que hay presencia de ovoalbúmina. Mientras que en la muestra del exterior podemos observar que da negativo, esto comprueba que el dializador cumplió su función al no dejar pasar proteínas al exterior.

Resultados obtenidos

	BIURET	AgNO3
Interior	+	+
Exterior	-	+